Comparatie intre electroforeza capilara si cea clasica in gel


25.06.2010

 

 Comparatie intre electroforeza capilara si cea clasica in gel

 

 

Andreea Chiva

 

 

Electroforeza proteinelor este o analiza de rutina, gelul de agaroza fiind cel mai utilizat suport. In pofida automatizarii sistemelor electroforetice si a disponibilitatii pe piata a reactivilor deja pregatiti pentru utilizare, aceasta tehnica este relativ laborioasa si supusa unor interferente multiple. Electroforeza capilara (CE) este o alternativa viabila la electroforeza clasica in gel (AGE), in special datorita faptului ca cele mai frecvente interferente cunoscute pentru tehnicile electroforetice (hemoliza, icterul si lactescenta serului, precum si artefactele legate de punctul de aplicare a probelor si prezenta componentelor monoclonale de concentratie scăzuta) raman fara efect asupra electroforezei capilare

 

Avantajele electroforezei capilare

- gradul mare de rezolutie, specificitate si sensibilitate

- rapiditatea conferita de posibilitatea analizei simultane a 10 probe/ ora (in cazul imunotiparii) pana la 80 probe/ ora (in cazul proteinelor serice). In termeni de timp vorbim despre 20 minute in electroforeza standard in gel de agaroza si de 120 s in electroforeza capilara.

- trasabilitatea totala de la proba primara pana la rezultat, precum si a lotului de reactivi

- implementarea programului de control de calitate pe 3 nivele cu posibilitate de prelucrare statistica a rezultatelor (curba Levey-Jennings) si a programului de transfer a rezultatelor pentru controlul inter laboratoare si a celui de acces la aceste rezultate

- posibilitatea conectarii la un scanner pentru importul si monitorizarea imaginilor obtinute pentru imunofixare (IF) sau a rezultatelor pentru proteine specifice

- diversificarea parametrilor de investigat prin posibilitatea determinarii, cu o rezolutie excelenta,  a sialoformele transferinei si a hemoglobinelor normale (Hb F si A) si patologice (Hb S, C, D, E, Bart) ale noului nascut.

- analiza directa a globulelor rosii nespalate, centrifugate sau decantate, hemoliza fiind efectuata de catre aparat

 

Elemente comparative intre electroforeza capilara si cea in gel

 

Sensibilitate si specificitate

Atat specificitatea cat si sensibilitatea CE  se situeaza la valori net superioare ( 97.2 % la CE fata de  93.5 % pentru AGE). Specificitatea celor două metode s-a situat la valoarea de 98.9 % în cazul CE si, respectiv,  93.7 %  pentru AGE.

 

Diferente calitative intre electroforegramele CE si AGE

Pentru serurile normale, se evidentiaza unele diferente intre modelele electroforetice obtinute prin cele doua metode:

 - fractiunile obtinute (albumina, alfa1, alfa2, beta si gama globuline) apar in ordine inversa pe cele doua tipuri de electroforegrame, datorita pozitiei diferite a  punctului de aplicare a probelor, in cazul AGE la catod si pentru CE la anod.

- rezolutia diferita in zona β. Unele probe supuse AGE pot prezenta benzi suplimentare in zonele de mobilitate α si β, fara a fi confirmate prin IF ca benzi monoclonale.

 

Pentru serurile cu componente monoclonale bine reprezentate, studiul comparativ al celor doua metode evidentiaza rezultate comparabile. In cazul artefactual al componentelor monoclonale de tip crioglobuline sau euglobuline, cu mobilitate redusa si care raman în punctul de aplicare a probelor, CE si-a dovedit net superioritatea fata de AGE, scazand astfel pretul de cost si timpul consumat cu imunofixarea. In plus, CE prezinta si avantajul controlului temperaturii de migrare prin mentinerea ei la 35.5 °C, ceea ce reduce riscul precipitarii crioglobulinelor in timpul migrarii.

Utilizarea CE pentru analiza proteinelor serice ar putea revolutiona determinarea imunoglobulinelor monoclonale ca rezultat a incorporarii unui component micro HPLC ceea ce ar conferi, la un cost mic, o rezolutie si  rapiditate mult mai mare fata de AGE.

 

Diferente cantitative intre electroforegramele CE si AGE

In plan cantitativ, s-a observat o bună corelatie intre CE şi AGE pentru albumina, α2 si γ globuline. Pentru α1 globuline rezultatele obtinute prin CE sunt, in medie, de 2.2 ori mai mari decat AGE. Aceste diferente s-ar putea explica, in parte, prin continutul crescut de acid sialic al α1 glicoproteinei acide care interfera in legarea proteinelor de colorantul folosit in AGE. CE nu prezinta aceasta problema deoarece tehnica nu foloseste colorant. O altă explicatie ar fi absenta liniei de baza la versiunea de software folosita de sistemul Capillarys SEBIA. Rezultatele pentru β globuline au prezentat un grad mic de corelatie pe electroforegramele CE si AGE datorita diferentei de mobilitate electroforetica a β lipoproteinelor (intre α2 si β pentru CE, de tip β pentru AGE). Diferente intre numarul de benzi  au fost raportate si pentru zona γ globulinica, neconfirmate insa ca monoclonale prin imunofixare. Aceste benzi se datoreaza  proteinelor cu mobilitate post gama (proteina C reactiva- CRP, produsi de degradare a C3). CRP in concentratie mai mare de 300 mg/l (ce apare pe electroforegrama ca o banda slaba in zona gama globulinica) poate interfera în determinarea gama globulinelor. Aceste situatii sunt rare si, deci, interferenta are o frecventă redusa.

 

Pentru paraproteinele in concentratie mare, rezultatele celor doua metode au fost comparabile.  CE s-a dovedit, insa, mult mai sensibila pentru componentele monoclonale de concentratie scazuta (prag de detectie 0.5 g/l). Prezentarea datelor comparative (calitative si cantitative) intre cele doua metode pledeaza pentru alegerea CE ca alternativa viabila la electroforeza clasica. Principalul motiv il constituie posibilitatea identificarii unor benzi anormale slab reprezentate ce scapa determinarii prin AGE, datorita faptului ca citirea valorilor procentuale relative ale fractiunilor in cazul CE se face la 214 nm si fara colorare. Folosirea colorantului ar putea induce artefacte ca urmare a modificarilor post translationale ale diverselor proteine conţinute in probele de analizat. De asemenea, timpul de colorare, cel de decolorare, precum si concentratia de colorant, pot influenta legarea acestuia de proteine si cuantificarea fractiunilor separate.

 

 

Referinte bibliografice

Chiva A- Investigatia electroforetica in diagnosticul de laborator-ghid de interpretare- Editura Universitara « Carol Davila » Bucureti 2008.

Clark R, Katzmann J A, Wiegert E, Namyst-Goldberg C, Sanders L, Oda RP, Kyle RA, Landers JP- Rapid capillary electrophoretic analysis of human serum proteins :qualitative comparison with high-throughput agarose gel electrophoresi- Journal of Chromatography A, 744 (1996) 205-213.

Gay-Bellile C et all - Automated Multicapillary Electrophoresis for Analysis of Human Serum Protein- Clin Chem 2003,49:11.

Larsson A, Hansson LO- Comparison between a Second Generation Automated Multicapillary Electrophoresis System with an Automated Agarose Gel Electrophoresis System for the Detection of M-Components- Upsala J Med Sci 2008;113 (1): 65-72.

Lissoir B, Wallemacq P, Maisin D- Électrophorèse des protéines sériques : comparaison de la technique en capillare de zone Capillarys ® (Sebia) et de l’ électrophorèse en gel d’agarose Hydrasys® (Sebia)- Ann Biol Clin 2003, 61 :557-62.

 

 

 

                        

Noutati


























Actualitati Medicale




















 

Introdu adresa ta de email pentru a te alatura noua.

 
Proiect realizat de AB T&Co              © Toate drepturile rezervate Electroforeza.ro 2009