Determinarea CDT prin electroforeza capilara: comparatie cu HPLC, performante si caracteristici


14.02.2012

 

Determinarea CDT prin electroforeza capilara: comparatie cu HPLC, performante si caracteristici

 

 

 

Andreea CHIVA

 

         Transferina (Tf), cea mai importanta proteina transportoare de fier din organism, este o beta glicoproteină formată din 679 aminoacizi cu o masă moleculară de 80 kDa. Molecula prezintă 2 domenii structurale globulare: N terminal (resturile 1-336) şi C terminal (resturile 337-679) şi mai multe nivele de heterogenitate determinate de substituţia unor aminoacizi din structura moleculei, conţinutul în acid sialic şi fier.

         Transferina deficienta in carbohidrati (CDT) este un termen larg utilizat in prezent pentru a evidentia o alterare temporara a profilului de glicozilare a Tf indusa de consumul de alcool.

         Descrisa inca din 1978 de Stibler ca fiind prezenta atat in serul, cat si in LCR-ul consumatorilor cronici de alcool, CDT este considerata, in prezent, cel mai sensibil si specific marker pentru abuzul de alcool. Daca initial termenul se referea la formele asialo (AST), monosialo (MoST) si disialo (Di ST), recent, grupul de cercetatori de la IFCC a propus excluderea din definitie a formei MoST. Acest lucru a avut la baza numeroase studii stiintifice care au demonstrat ca forma monosialo este frecvent asociata cu trisialo, fara legatura, insa, cu consumul de alcool. Asadar, in prezent, termenul de CDT exprima suma dintre valoarea procentuala a formelor asialo si disialotransferina.

 

Metodele de determinare a CDT sunt variate, cele mai importante fiind: focusarea izoelectrica asociata cu imunofixarea, cromatografia pe schimbatori de ioni cuplata cu turbidimetrie, nefelometria, HPLC si electroforeza capilara (CE). Dintre acestea, HPLC si CE sunt cele mai des utilizate, datorita specificitatii si sensibilitatii mari si a posibilitatii identificarii variantelor genetice de transferina.

Alegerea si utilizarea unei metode de mare specificitate si sensibilitate mare este esentiala pentru studiul CDT. Paramentrul prezinta importanta clinica deosebita atat in medicina muncii (aviatie, constructii), cat si in monitorizarea consumatorilor cronici de alcool in randul soferilor. In absenta unei metode specifice si sensibile, rezultatele analizelor devin nesatisfacatoare, cu consecinte grave (pierderea locului de munca, amanarea nejustificata a redobandirii carnetului de conducere, indeosebi la soferii profesionisti).

 

Studii de data recenta s-au focusat pe caracteristicile si performantele CE in sistemul Capillarys 2 SEBIA Franta, precum si pe comparatia intre CE si HPLC (metoda considerata de referinta).

 

Electroforeza capilara in sistem Capillarys 2 SEBIA Franta se efectueaza dupa o prealabila saturare a probelor cu fier. Ulterior, izoformele Tf sunt separate electroforetic la 8200 V in tampon alcalin pH 8.8 si cuantificate prin masurarea absorbantei la 200 nm a peptidelor legate.

 

Performantele si caracteristicile electroforezei capilare SEBIA Franta au fost comparate cu  HPLC efectuata pe diverse echipamente [1,2]. Dupa saturarea probelor cu fier si extractia lipidelor (delipidare), probele sunt injectate in sistemul HPLC. Separarea izoformelor are loc pe o coloana schimbatoare de ioni, iar cuantificarea lor prin masurarea absorbantei complexelor Fe – transferina la 470 nm.

 

 

Doua studii comparative de data recenta retin atentia. Este vorba despre studiul lui Schellenberg si Wielders dat publicitatii in 2010 in Clin Chem Acta si cel al lui Daves si colab (2011) publicat in Clin Chem Lab Med.

 

Datele lor releva cateva aspecte importante:

1. Gradul de corelatie mare intre rezultatele obtinute pe HPLC si cele obtinute prin CE, desi valorile CE au fost mai mici pentru CE. Pentru valorile CDT cuprinse intre 1.3-1.9%, gradul de corelatie a foct mai mic decat pentru valorile CDT>2%, in special pentru valorile aflate in apropiere de limita superioara (1.9% pentru CDT CE fata de 3% pentru CDT HPLC). Pentru valorile CDT situate la limita inferioara, rezultatele au diferit putin (1.3% pentru CDT CE fata de 1.2% pentru CDT HPLC). Pentru valorile CDT >2% , gradul de corelatie a fost mult mai mare (2% pentru CDT CE fata de 1.76% pentru CDT HPLC pentru valorile mici si 9.5% pentru CDT CE fata de 9.82% pentru CDT HPLC, daca ne referim la valorile mari) [1].

 

2. Limita superioara a domeniului de normalitate calculata prin ambele studii a fost de 1.3%, iar cut off-ul de 1.6%. Valorile cuprinse intre 1.3-1.6% sunt considerate neconcludente si trebuie reevaluate prin alta metoda.

 

3. In ceea ce priveste precizia, rezultatele CE au fost comparabile cu HPLC. Imprecizia calculata s-a situat sub 5%, iar linearitatea cuprinsa intre 2-20% [2].

 

4. Atat HPLC, cat si CE pot identifica variantele genetice ale transferinei BC si CD. Prezenta lor poate insa interfera in determinarea CDT, prin ambele metode [2].

 

5. Valoarea bias-ului obtinuta prin studii statistice interlaboratoare evidentiaza necesitatea standardizarii tehnicilor de determinare si  calibrarea cu materiale de referinta internationale. Diferente intre laboratoare au fost observate si in ceea ce priveste tipul de sistem de electroforeza capilara folosit (monocapliar sau multicapilar).

 

Concluzii

Electroforeza capilara este o metoda robusta de determinare a CDT, cu utilitate clinica mare atat in medicina muncii, cat si in siguranta rutiera.

Accesibilitatea metodei, rapiditatea, gradul mare de corelatie cu HPLC, o recomanda ca alternativa viabila la HPLC, cu potential mare de standardizare si introducere rapida in uzul curent ca tehnica de referinta.

 

Referinte bibliografice

 

1.Daves M, Cemin R, Floreani M, Pusceddu I, Cosio G, Lippi – Comparative evaluation of capillary zone electrophoresis and HPLC in the determination of carbohydrate-deficient transferrin. Clin Chem Lab Med 2011; 49(10):1677-1680.

2. Schellenberg F, Wielders JPM- Evaluation of capillary electrophoresis assay for CDT on SEBIA Capillarys System: Intra and inter laboratory precision, reference interval and cut-off. Clin Chem Acta 2010; 411:1888-1893.

 

Noutati


























Actualitati Medicale




















 

Introdu adresa ta de email pentru a te alatura noua.

 
Proiect realizat de AB T&Co              © Toate drepturile rezervate Electroforeza.ro 2009